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PCR注意事項(xiàng)
  • 發(fā)布日期:2018-06-07     信息來源:      瀏覽次數(shù):3013
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      PCR產(chǎn)物的電泳檢測時(shí)間
      一般為48h以內(nèi),有些應(yīng)該于當(dāng)日電泳檢測,大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。
      假陰性,不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶
      PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備,②引物的質(zhì)量與特異性,③酶的質(zhì)量及, ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。
      模板:①模板中含有雜蛋白質(zhì),②模板中含有Taq酶抑制劑,③模板中蛋白質(zhì)沒有消 化除凈,特別是染色體中的組蛋白,④在提取制備模板時(shí)丟失過多,或吸入酚。⑤模 板核酸變性不*。在酶和引物質(zhì)量好時(shí),不出現(xiàn)擴(kuò)增帶,極有可能是標(biāo)本的消化處 理,模板核酸提取過程出了毛病,因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液,其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改。
      酶失活:需更換新酶,或新舊兩種酶同時(shí)使用,以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。
      引物:引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱,是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題,兩條引物一條濃度 高,一條濃度低,造成低效率的不對稱擴(kuò)增,對策為:①選定一個(gè)好的引物合成單 位。②引物的濃度不僅要看OD值,更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,一定要有引物條帶出現(xiàn),而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致,如一條引物有條帶,一條引物無條帶,此時(shí)做PCR有可能失敗,應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高,一條亮度低,在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存,防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分,導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計(jì)不合理,如引物長度不夠,引物之間形成二聚體等。
      Mg2+濃度:Mg2+離子濃度對PCR擴(kuò)增效率影響很大,濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特 異性,濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。
      反應(yīng)體積的改變:通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul,應(yīng)用多 大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增,是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定,在做小體積如20ul 后,再做大體積時(shí),一定要模索條件,否則容易失敗。
      物理原因:變性對PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要,如變性溫度低,變性時(shí)間短,極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低,可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì),檢測一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度,這也是PCR失敗的原因之一。
      靶序列變異:如靶序列發(fā)生突變或缺失,影響引物與模板特異性結(jié)合,或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列,其PCR擴(kuò)增是不會成功的。
      假陽性
      出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致,有時(shí)其條帶更整齊,亮度更高。
      引物設(shè)計(jì)不合適:選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性,因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí),擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計(jì)引物。
      靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染:這種污染有兩種原因:一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染,導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決:操作時(shí)應(yīng)小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,所有試劑或器材均應(yīng)高壓處理。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí),在加標(biāo)本前,反應(yīng)管和試劑用紫外線照射,以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染,這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性??苫ハ嗥?/span>

      上海嘉鵬科技有限公司專業(yè)生產(chǎn):紫外分析儀、三用紫外分析儀、暗箱式紫外分析儀、暗箱三用紫外分析儀、暗箱紫外分析儀、手提式紫外分析儀、三用紫外分析儀暗箱式、紫外檢測儀、部分收集器、恒流泵、蠕動(dòng)泵、凝膠成像系統(tǒng)、凝膠成像分析系統(tǒng)、化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)、光化學(xué)反應(yīng)儀、旋渦混合器、漩渦混合器、玻璃層析柱、梯度混合器、梯度混合儀、核酸蛋白檢測儀、玻璃層析柱、熒光增白劑測定儀、餾分收集器、切膠儀、藍(lán)光切膠儀、層析系統(tǒng)等產(chǎn)品。

       

      PCR產(chǎn)物的電泳檢測時(shí)間
      一般為48h以內(nèi),有些應(yīng)該于當(dāng)日電泳檢測,大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。
      假陰性,不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶
      PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備,②引物的質(zhì)量與特異性,③酶的質(zhì)量及, ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。
      模板:①模板中含有雜蛋白質(zhì),②模板中含有Taq酶抑制劑,③模板中蛋白質(zhì)沒有消 化除凈,特別是染色體中的組蛋白,④在提取制備模板時(shí)丟失過多,或吸入酚。⑤模 板核酸變性不*。在酶和引物質(zhì)量好時(shí),不出現(xiàn)擴(kuò)增帶,極有可能是標(biāo)本的消化處 理,模板核酸提取過程出了毛病,因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液,其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改。
      酶失活:需更換新酶,或新舊兩種酶同時(shí)使用,以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。
      引物:引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱,是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題,兩條引物一條濃度 高,一條濃度低,造成低效率的不對稱擴(kuò)增,對策為:①選定一個(gè)好的引物合成單 位。②引物的濃度不僅要看OD值,更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,一定要有引物條帶出現(xiàn),而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致,如一條引物有條帶,一條引物無條帶,此時(shí)做PCR有可能失敗,應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高,一條亮度低,在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存,防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分,導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計(jì)不合理,如引物長度不夠,引物之間形成二聚體等。
      Mg2+濃度:Mg2+離子濃度對PCR擴(kuò)增效率影響很大,濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特 異性,濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。
      反應(yīng)體積的改變:通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul?;?00ul,應(yīng)用多 大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增,是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定,在做小體積如20ul 后,再做大體積時(shí),一定要模索條件,否則容易失敗。
      物理原因:變性對PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要,如變性溫度低,變性時(shí)間短,極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低,可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì),檢測一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度,這也是PCR失敗的原因之一。
      靶序列變異:如靶序列發(fā)生突變或缺失,影響引物與模板特異性結(jié)合,或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列,其PCR擴(kuò)增是不會成功的。
      假陽性
      出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致,有時(shí)其條帶更整齊,亮度更高。
      引物設(shè)計(jì)不合適:選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性,因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí),擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計(jì)引物。
      靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染:這種污染有兩種原因:一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染,導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決:操作時(shí)應(yīng)小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,所有試劑或器材均應(yīng)高壓處理。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí),在加標(biāo)本前,反應(yīng)管和試劑用紫外線照射,以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染,這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性??苫ハ嗥?/span>

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